Ordem anura

2-REVISÃO DE LITERATURA

2.1- Ordem Anura: importância ambiental

No mundo existem mais de 5.500 espécies de anuros (Frost, 2008).

Aproximadamente metade destas espécies ocorre na Região Neotropical (Heinicke

et al., 2007). No Brasil, até o presente estão descritas 841 espécies deste grupo,

sendo que 813 pertencentes à ordem Anura (SBH, 2009). Os anuros desempenham

papel importante nas cadeias alimentares, controlando populações de vários

invertebrados, principalmente insetos. Além disso, podem ser utilizados como

bioindicadores da qualidade do ambiente, pois são muito sensíveis as alterações

ambientais, principalmente em virtude de sua pele permeável e devido aos girinos

(estágio larval), serem bastante afetados por substâncias dissolvidas na água.

Assim, a qualidade de um ambiente pode ser avaliada pela presença de anfíbios e

pela sua reprodução com sucesso (Bertoluci, 2002).

2.2- A família Hylidae e o gênero

Phyllomedusa

A família Hylidae apresenta a maior riqueza em espécies. Taxonomicamente

é dividida em quatro subfamílias: Hemiphractinae, Pelodryadinae, Hylinae e

Phyllomedusinae (Faivovich et al. 2005).

A subfamília Phyllomedusinae é composta pelos gêneros

Agalychnis,

Hylomantis

, Pachymedusa, Phasmahyla, Phrynomedusa, Cruziohyla e

Phyllomedusa

Segundo Faivovich et al. (2005) o gênero

filogenia completamente resolvidas. Segundo estes autores, este gênero inclui as

espécies de Phyllomedusinae que não se encaixam nos demais gêneros.

. Este último, atualmente contém 32 espécies descritas (Frost, 2008).Phyllomedusa não apresenta taxonomia e

Phyllomedusa

está organizado em grupos de espécies, sendo reconhecidos quatro

4

grupos taxonomicamente distintos:

perinesos, Phyllomedusa tarsius

algumas espécies como

tomopterna

grupos. Além desta problemática, o monofiletismo deste grupo não foi testado

(Faivovich et al. 2005).

Phyllomedusa burmeisteri, Phyllomedusae Phyllomedusa hypochondrialis, entretanto,Phyllomedusa bicolor, Phyllomedusa palliata, Phyllomedusae Phyllomedusa vaillanti, ainda não estão definidas em nenhum destes

2.3-Declínio da diversidade de anfíbios e conservação

Estudos revelam que as populações de anfíbios estão declinando em todo

mundo. Entre os fatores envolvidos estão a perda e fragmentação de hábitat que

afetam os anfíbios e outros organismos em função do isolamento das populações,

da endogamia e do efeito de borda (Hanski, 1998; Beebe; Griffiths, 2005; Cushman,

2006). Além destes, outro efeito da fragmentação do habitat é a necessidade dos

indivíduos de migrarem por áreas maiores em busca de poças ou vegetação para a

reprodução, ficando assim mais expostos a efeitos como desidratação, predação e

poluentes em geral. Anfíbios com reprodução terrestre sofrem menos com este

efeito uma vez que não precisam migrar em busca de ambientes aquáticos (Becker

et al., 2007).

Outro fator importante que tem contribuído para o declínio dos anfíbios é a

contaminação pelo fungo

potencial virulento e que tem sido responsável pelo declínio de várias populações

mesmo em ambientes preservados (Pounds et al., 2006). Populações de anfíbios

também são afetadas com as alterações climáticas (Pounds et al., 2006), radiação

ultra-violeta, introdução de espécies exóticas (Yung et al., 2001) e compostos

químicos utilizados na agricultura (Beebee; Griffiths, 2005).

Segundo Baillie et al. (2004) não é possível determinar o grau de declínio em

grupos pouco estudados. No entanto, muitos grupos relativamente bem estudados

de plantas, aves, mamíferos, moluscos e anfíbios têm apresentado altos índices de

extinções. Para mamíferos, aves e anfíbios acredita-se que a extinção seja seletiva,

ocorrendo principalmente em determinados gêneros e famílias. Até 2004, a

Batrachochytrium dendrobatidis, um patógeno com altoWorld

5

Conservation Union

risco de extinção ou vulneráveis (Baillie et al., 2004).

A distribuição geográfica das espécies em declínio também não é ao acaso.

Espécies Neotropicais são mais afetadas que as Afrotropicais e da região

Indomalaia (Stuart et al., 2004). No Brasil, os estudos voltados para o declínio dos

anfíbios apontam alterações nas populações de 31 espécies de anuros das famílias

Leptodactylidae, Hylidae, Centrolenidae, Dendrobatidae e Bufonidae. Para estas

espécies, a competição entre as espécies em função da perda e alteração do habitat

são apontados como principais fatores que levaram à redução destas populações

(Eterovick, 2005).

Yung et al. (2001) relatam que o declínio de várias espécies de anfíbios

demonstra a necessidade de mais programas de pesquisa e de estratégias

imediatas para o manejo e conservação dos anfíbios, especialmente em regiões

onde os dados sobre a biodiversidade, abundância e distribuição das espécies ainda

são poucos. Cushman (2006) e Azevedo-Ramos e Galetti (2001) enfatizam as

grandes diferenças entre as espécies de anfíbios com relação ao habitat e às

mudanças no seu ambiente e afirmam que uma conservação efetiva requer ações

que possam atender as diferentes espécies nas suas particularidades.

O Brasil apresenta dois biomas classificados como

ameaçada, o Cerrado e a Mata Atlântica. Até o ano de 2001, para estes dois

biomas, eram descritas 150 e 280 espécies de anfíbios respectivamente, sendo

muitas destas espécies endêmicas destes biomas (Myers et al., 2000). No entanto,

sabe-se que o número de espécies descritas para estas regiões tem aumentado

anualmente em função dos estudos de levantamento e revisões taxonômicas que

vem sendo realizados. Apesar da riqueza de espécies, a condição de

biodiversidade ameaçada preocupa os ambientalistas com relação a integridade

destes biomas e das espécies ali presentes.

Estudos genéticos envolvendo este grupo, principalmente em biomas

ameaçados como a Mata Atlântica são de suma importância, uma vez que

proporcionam dados que auxiliam na compreensão da real biodiversidade local e da

diferenciação cariotípica existente entre as diferentes populações. Os dados obtidos

considerou 35 espécies de anfíbios como extintas e 1.856 emhotspots de biodiversidadehotspots de

6

à partir de análises citogenéticas são importantes para complementar as

informações necessárias em projetos de manejo e conservação destas populações e

dos biomas nas quais estão inseridas.

2.4-A citogenética e suas aplicações em estudos com anuros

A Citogenética é uma ciência que surgiu no início do século XX pela união

da Genética e da Citologia e estuda a estrutura cromossômica relacionada com a

sua morfologia, organização, função, replicação, evolução e variação (Guerra,

1988). É uma ferramenta utilizada em estudos sobre variabilidade genética (Sumner,

2003), filogenéticos e taxonômicos (Dobigny, et al., 2004).

As informações obtidas através da citogenética podem revelar diferenças e

similaridades não visíveis em nível morfológico. A grande vantagem é que estudos

citogenéticos podem atingir diferentes níveis da organização do genoma desde

estrutura até constituição molecular dos cromossomos, dependendo da técnica

aplicada. Os cromossomos podem ser estudados com relação ao seu número,

tamanho, forma e comportamento durante a divisão celular. Análises envolvendo o

nível de ploidia ou meiose podem proporcionar informações únicas sobre os

sistemas de entrecruzamentos ou modos de herança. Diferentes bandeamentos

cromossômicos podem revelar aspectos da estrutura geral e organização da

cromatina, além da localização de determinados genes ou sequências (Hillis, et. al.,

1996). Em estudos evolutivos, essas técnicas auxiliam no detalhamento das

transformações que ocorreram em grupos de espécies próximas, com cariótipos

muito semelhantes (Guerra, 1988).

A coloração convencional com Giemsa (azul de metileno e eosina) cora o

DNA e as proteínas associadas, o que possibilita uma boa visualização do

cromossomo e do centrômero na maioria dos organismos. Desta forma, permite

determinar o número e a morfologia, além de identificar heteromorfismos com

relação ao tamanho dos cromossomos.

O bandeamento C é utilizado para evidenciar a heterocromatina dentro do

genoma (Sumner, 1990). A heterocromatina é caracterizada por seu alto índice de

7

condensação, sequências repetidas de pares de base, pouca quantidade de genes,

não recombinação meiótica e replicação tardia do DNA (Grewal; Elgin, 2007), tendo

a sua replicação iniciada apenas no final da fase “S”.

Uma das características da heterocromatina que ainda gera

questionamentos entre os pesquisadores está relacionada à sua função no genoma.

Estudos indicam que esta região estaria envolvida no silenciamento gênico (Grewal;

Jia, 2007) e na organização nucleolar (Csink; Henikoff, 1996). Ainda, foi sugerido

que a heterocromatina estaria envolvida na recuperação da estabilidade telomérica

após eventos de fissões cêntricas, além de apresentar uma participação direta na

evolução cromossômica em alguns grupos de indivíduos (Imai, 1991; Imai et al.,

1988).

A distribuição da heterocromatina no cariótipo não acontece ao acaso. Os

segmentos heterocromáticos tendem a localizar-se na região pericentromérica dos

cromossomos, nos telômeros ou nas proximidades das regiões organizadoras de

nucléolos (Pieczark; Mattevi, 1998). Segundo Imai (1991), de acordo com o padrão

de distribuição nos cromossomos, a heterocromatina pode ser dividida em dois

grupos: no grupo I, que abrange entre outros, os mamíferos, peixes e formigas, a

heterocromatina encontra-se preferencialmente na região pericentromérica dos

cromossomos, enquanto no grupo II, encontrada nos anfíbios, gafanhotos e plantas,

a heterocromatina predomina na região terminal ou intersticial.

Schmid (1978), ao estudar espécies de

heterocromatina nestes dois gêneros como banda-C positiva fortemente marcada,

banda-C positiva fracamente marcada e banda-C positiva telomérica fracamente

marcada. Para estes dois gêneros duas regiões cromossômicas apareceram sempre

marcadas: regiões pericêntricas e teloméricas.

Por ser uma região com altos índices de rearranjos, o estudo da

heterocromatina é de suma importância para a compreensão dos processos

evolutivos e para evidenciar as variações cromossômicas como translocações e

inversões (Guerra, 1988).

Bufo e Hyla, classificou a

8

Outra técnica utilizada no estudo do cariótipo é a coloração por

fluorocromos, que fornecem informações a respeito da composição de pares de

bases de regiões dos cromossomos. Os fluorocromos são substâncias que

fluorescem quando expostos a um comprimento de onda específico. Em estudos

citogenéticos são utilizados fluorocromos que se intercalam no DNA e nessa

categoria, existem dois tipos: os que se ligam aos pares de base AT e GC,

respectivamente. Dentre os vários tipos existentes, os mais comumente utilizados

são DAPI (4’-6’-diamidino-2-phenylindole) e a Cromomicina A

Mattevi, 1998).

O DAPI possibilita evidenciar regiões ricas em pares de base AT e pode ser

utilizado juntamente com o contracorante DA (distamicina A), em conjunto, estes

fluorocromos fornecem um sinal mais específico para estas regiões. A Cromomicina

A

Em espécies de

que as regiões de NOR são ricas em pares de base GC e a heterocromatina

apresenta regiões com marcações AT e regiões GC positivas (Lourenço et al.,

2000).

A técnica de impregnação por Nitrato de Prata (AgNO

NOR, inicialmente proposta por Howell e Black (1980) evidencia as NORs (

Organizer Regions

os genes de rRNA. Os nucléolos são as estruturas visíveis na intérfase em função

da transcrição dos genes presentes na NOR (Warner, 1979).

Embora sabe-se que a transcrição dos genes de rRNA ocorre nos nucléolos,

o sítio exato, nos nucléolos, onde ela ocorre ainda não foi bem identificado. Análises

de microscopia eletrônica em estudos com cromossomos metafásicos tratados com

nitrato de prata, demonstraram que o material impregnado pela prata está localizado

ao redor dos cromossomos e não diretamente na fita de cromatina (Schwarzacher et

al., 1978). Estudos que combinaram as técnicas de banda NOR e fluorocromos

específicos para RNA, demonstraram marcações positivas no centro fibrilar e no

centro fibrilar denso, indicando que estas regiões do nucléolo participam do

processo de transcrição do rRNA (Wachtler; Musil, 1979).

3 (CMA3) (Pieczarka;3 é um antibiótico que tem afinidade pelos pares de base GC (Schweizer, 1976).Paratelmatobius, as análises com fluorocromos têm demonstrado3) ou bandeamento Ag-Nucleoli) ativas. As NORs são as regiões dos cromossomos que contém

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Em muitos organismos, o gene do rRNA é formado pelas subunidades 18S,

28S e 5,8S, que são transcritos como uma unidade única de rRNA 45S que

posteriormente é processado nas unidades individuais dos ribossomos. Apesar de

existir uma homologia considerável entre os genes ribossomais em diferentes

organismos, o tamanho dos genes de rRNA, os espaçadores entre os genes e o

número de cópias nos diferentes organismos é altamente variável. Organismos com

genoma pequeno (fungos, protistas, e alguns insetos) apresentam menos que 100

cópias de genes de rRNA. No outro extremo, algumas plantas e anfíbios apresentam

mais de 10 mil cópias. Humanos tem cerca de 200 cópias de genes de rRNA

(Sumner, 2003).

Polimorfismo no número de cópias é relativamente comum, tanto entre

cromossomos homólogos de um indivíduo quanto entre indivíduos. Em algumas

espécies, o gene de rRNA está restrito a um único sítio em um par de cromossomos

homólogos embora normalmente eles estejam distribuídos por vários cromossomos.

As NORs podem estar localizadas em diferentes locais nos cromossomos, embora

freqüentemente estejam próximas às regiões terminais, sítios intersticiais também

ocorrem (Sumner, 2003).

Schmid (1978) analisou 47 espécies de

de apenas duas NORs. Por meio de inversões e translocações, as NORs teriam sido

transferidas inteiramente para outros cromossomos, em vez de inúmeras e

pequenas unidades espalhadas pelo genoma, como pode ser observado em outras

espécies. Assim, apesar da intensa especiação, o número de NORs teria

permanecido constante durante a evolução de

que a presença de um único sítio de NOR seria um estágio plesiomórfico quando

comparado com o estado de NORs múltiplas. Schmid (1982) ao analisar espécies de

23 gêneros de anuros, verificou que para a maioria das espécies, a NOR esteve

localizada na região intersticial ou na posição subterminal dos cromossomos.

As NORs normalmente são visíveis nos cromossomos como uma constrição

secundária ou satélite. Essa conformação pode ser devido a uma diferença na

estrutura com relação ao restante da cromatina, ou pode ser causada por uma

diferença na condensação do cromossomo. As NORs transcricionalmente ativas

Bufo e Hyla, e verificou a ocorrênciaBufo e Hyla. King et al. (1990) sugere

10

continuam transcrevendo RNA durante a prófase o que pode promover uma

condensação mais tardia do que o restante do cromossomo (Pikaard, 1999; Sumner,

2003).

Os nucléolos desaparecem na prófase, fase em que o envelope nuclear é

desfeito. Ao mesmo tempo cessa a transcrição do RNA, aparentemente em função

da fosforilação do fator de transcrição SL1. Alguns componentes nucleolares

permanecem nas NORs durante a metáfase e anáfase, em particular a RNA

polimerase I e o fator de transcrição UBF e SL1, as quais são as principais proteínas

que são impregnadas pelo nitrato de prata durante a técnica de bandeamento NOR

(Sumner, 2003).

2.5- Cenário geral da citogenética de anuros

A maioria dos estudos com anuros enfoca a sua taxonomia e etologia. No

entanto, os dados citogenéticos publicados para este grupo tem trazido informações

importantes com relação a número e morfologia dos cromossomos, composição e

distribuição da heterocromatina e distribuição dos pares de base no genoma (Wiley,

et al. 1989; Lourenço et al, 1998, 2000; Amaro-Ghilardi, et al. 2006; Silva et al, 1999,

2001, 2006; Bogart, 1974; Campos; Kasahara, 2006).

No gênero

2n=22 à 2n=26 (Bogart, 1974) e em uma revisão realizada para o gênero

Leptodactylus foi encontrado número cromossômico variando de

Eleutherodactylus,

2n=36. Para estes dois gêneros, Bogart (1974) e Campos e Kasahara (2006),

sugerem que a ocorrência de eventos como rearranjos do tipo Robertsoniano teriam

predominado resultando em diferentes números e morfologias cromossômicas, mas

outros eventos como inversões, translocações recíprocas e ganho ou perda de

heterocromatina, certamente teriam contribuído na diferenciação cariotípica das

espécies.

Nas espécies da família Hylidae, variações no número cromossômico entre os

diferentes gêneros também foram observadas. O número cromossômico 2n=24 foi

determinado para espécies dos gêneros

1978; Wiley, 2003), 2n=26 para

Campos e Kasahara (2006) encontraram variações de 2n=18 àLitoria e Hyla (King et al, 1990; Schmid,Cyclorana novaehollandiae e Gastrotheca pseustes

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(King et al, 1990; Schmid 1990) e 2n=30 para

também foi observado número cromossômico de 2n=31 devido a presença de um

cromossomo B em alguns indivíduos analisados (Medeiros et al, 2006).

Estudos genéticos voltados para o gênero

Haddad, et al, (1994) estudaram a espécie

ocorrência de poliploidia, com valor de número diplóide de 2n=52 cromossomos.

Mais recentemente, Kasahara et al. (2007) descreveram o número cromossômico de

2n=26 para

Dendropsopus nanus. Nesta últimaPhyllomedusa são escassos.P. tetraploidea na qual foi verificada aP. distincta e dados obtidos com o estudo de um híbrido triplóide entreP. tetraploidea e P. distincta.